Enzymy restrykcyjne to enzymy, które tną zarówno DNA jedno-, jak i dwuniciowe. Każdy enzym restrykcyjny ma określoną sekwencję nukleotydową, zwaną miejscem restrykcyjnym, którą rozpoznaje i kroi. Enzymy restrykcyjne stosuje się do sekwencjonowania DNA, analizy mutacji oraz klonowania i amplifikacji DNA. Naukowcy używają enzymów restrykcyjnych do wstawiania genów będących przedmiotem zainteresowania do wektorów ekspresyjnych, cząsteczek DNA, które mogą replikować oddzielnie od chromosomalnego DNA. Wektor zawierający interesujący gen można następnie wprowadzić do szczepu bakteryjnego w celu ekspresji i charakteryzacji białek.
Wideo dnia
Krok 1
Zidentyfikuj miejsca enzymów restrykcyjnych w twoim wektorze, patrząc na mapę restrykcyjną. Mapa restrykcyjna powie ci, które enzymy przetną Twój wektor i gdzie.
Etap 2
Wybierz enzym restrykcyjny, który ma również miejsce obecne na wstawionym genomie, patrząc na sekwencję wstawki. Upewnij się, że miejsce restrykcyjne znajduje się na twojej wstawce, która znajduje się poza genem będącym przedmiotem zainteresowania, więc nie utracisz żadnej części genu.
Krok 3
Upewnij się, że nie ma duplikatów miejsca restrykcyjnego w dowolnym miejscu wstawki genu lub wektora. Spowoduje to wielokrotne cięcia w DNA i wprowadzi w błąd dane.
Krok 4
Spróbuj wybrać enzymy restrykcyjne, które cięte lepkimi końcami, zamiast tępych końcówek. Lepkie końce pojawiają się, gdy enzym przecina dwuniciowy DNA w sposób z przesunięciem, pozostawiając jednoniciowy zwis, który ułatwia mocowanie za pomocą nacięcia wkładki w przeciwny sposób. Tępe końce występują, gdy dwuniciowy DNA jest cięty w gładki sposób, a te są trudniejsze do przyczepienia.
Krok 5
Wybierz inny enzym restrykcyjny dla obu końcówek REPLACEu, aby upewnić się, że jest on wstawiony do wektora w prawidłowej orientacji i aby upewnić się, że wektor nie przywiązuje się do siebie.
Krok 6
Spróbuj wybrać dwa enzymy restrykcyjne, które dobrze działają w tym samym systemie buforowym i temperaturze. Jeśli nie jest to możliwe, uruchamiaj każde trawienie osobno.
Rzeczy, które będą potrzebne
- Sekwencja wstawki genu
- Mapa restrykcyjna dla wektora wyboru
- Lista enzymów restrykcyjnych i ich miejsc cięcia
Wskazówki
- Opracowano niektóre programy internetowe do identyfikacji miejsca restrykcyjne na sekwencji DNA szybko. Jeden taki program pochodzi z New England BioLabs.
